2023-12-082023-12-08https://hdl.handle.net/11420/44533Hochskalieren von Bioprozessen führt oft zu Produktivitätseinbußen im Vergleich zu Prozessen im Labormaßstab. Ein Grund ist das Entstehen von Populationsheterogenität, das zwar gut untersucht, aber mechanistisch wenig verstanden ist. Während der ersten Förderphase (Projekt ProPHet) wurde das quantitative Verständnis von Populationsheterogenität, die durch Zell-Bioreaktor-Interaktion in Zulaufprozessen mit E. coli FUS4 (pF81kan) zur Umwandlung von Glycerin in L-Phenylalanin (L-Phe) entstehen, erhöht. Die experimentelle Untersuchung wurde mit einem Vierfach-Reporter Stamm durchgeführt, der Informationen über Wachstum, generelle Stressantwort, Sauerstoffverfügbarkeit und Produktbildung einzelner Zellen liefert. Kultivierungen im Rührkesselreaktor (STR) wurden mit großtechnischen Prozessbedingungen verglichen, die im multi-Kompartiment Reaktor simuliert wurden, der aus einem STR und einem neuartigen Bypass-Reaktor, der als Coiled Flow Inverter (CFI) ausgelegt ist, besteht. Die theoretische Untersuchung wurde mit Populationsbilanz-Gleichungen und Agenten-basierter Modellierung durchgeführt, nachdem ein grobes Modell der Zellkomponenten generiert wurde.ProPHet2Con zielt darauf ab durch Populationsheterogenität verursachte Schwankungen der Prozessleistung in Zulaufprozessen zur L-Phe Produktion zu kontrollieren. Ein für die Prozessleistung positiver Populationsheterogenitätsgrad wird durch Förderung von Subpopulationen mit vorteilhaften Eigenschaften aufrechterhalten. Besonderes Augenmerk wird dabei auf den Prozess im STR-CFI gelegt.Vor Implementierung der Prozesssteuerung wird der L-Phe Produktionsprozess unter Anwendung des groben Modells der Zellkomponenten und stöchiometrischer Modellierung in Bezug auf finale Produkttiter und Produktivität optimiert, insbesondere im STR-CFI.Voraussetzung für die Beeinflussung des Populationsheterogenitätgrads durch automatisierte Prozesssteuerung, wird die manuelle Durchflusszytometriemessung durch automatisierte Echtzeit-Durchflusszytometrie (ART-FCM) ersetzt. Der ART-FCM-Aufbau wird durch das kürzlich veröffentlichte Prozesskonzept Segregostat erweitert, das es ermöglicht, den Grad der Diversifizierung einer Bioreaktorpopulation durch Einzelzellphysiologie-basierte Zuführung der Kohlenstoffquelle auf einen Sollwert zu regeln. Darüber hinaus werden modellbasierte Soft Sensoren zur Schätzung nicht messbarer Parameter implementiert. Basierend auf experimentellen Untersuchungen sollen Strategien formuliert werden, um den Populationsheterogenitätsgrad durch modellbasierte Prozessrückkopplungskontrolle nach ART-FCM-Messung der Einzelzellphysiologie zu beeinflussen. Eine solche Kopplung zwischen ART-FCM und fortschrittlicher modell-basierter Prozesssteuerung wurde unseres Wissens bisher nie realisiert. Die formulierten Strategien werden im Zulaufprozess zur L-Phe Produktion experimentall validiert.Sobald die Prozesssteuerung realisiert ist, wird das Skalierungs-Potenzial des Prozesses in den Pilotmaßstab untersucht.Upscaling of bioprocesses is often accompanied by loss in productivity compared to well-mixed lab-scale processes. One reason is the formation of population heterogeneity whose mechanistic understanding is still comparably low. During the first funding period (project ProPHet) quantitative understanding of population heterogeneity originating from cell-bioreactor interaction in fed-batch processes with E. coli FUS4 (pF81kan) converting glycerol to L-phenylalanine (L-Phe) was raised. Experimental investigation was done with a quadruple reporter strain monitoring growth, general stress response, oxygen availability and product formation of single cells. Cultivations in a well-mixed stirred-tank bioreactor (STR) were compared with large-scale bioprocess conditions simulated in a scale-down reactor system consisting of a STR and a novel by-pass reactor that is designed as a coiled flow inverter (CFI). Theoretical investigation was done with population balance equations and agent based modeling after generating a non-segregated coarse-grained model. Building upon results from ProPHet, ProPHet2Con is aiming at controlling population heterogeneity induced variations in process performance in the fed-batch processes for L-Phe production. A population heterogeneity level that is beneficial for process performance will be maintained by promoting the abundance of subpopulations with advantageous characteristics. A special focus will be put on the process in the STR-CFI. Prio to implementation of process control, the L-Phe production process will be optimized applying the coarse-grained model and stoichiometric modeling to improve final product titer and productivity, especially in the STR-CFI setup. As a prerequisite for influencing the level of population heterogeneity by automated process control, manual at-line flow cytometry measurement will be replaced by automated real-time flow cytometry (ART-FCM). The ART-FCM setup will be advanced by the previously published process concept segregostat, that allows to control the degree of diversification of a bioreactor population at a predefined setpoint by single-cell physiology-based feeding of the carbon source. Furthermore, model-based soft sensors will implemented to estimate quantities cannot be measured directly. Then, based on the outcome of experimental investigations, strategies will be formulated to influence the level of population heterogeneity by model-based process feedback control following ART-FCM evaluation of single cell physiology. To our knowledge such a coupling between ART-FCM and an advanced model-based process control has so far never been realized. The formulated strategies will be experimentally validated in the fed-batch process for L-Phe production in the STR and the STR-CFI.Once process control for L-Phe production is realized, scale-up potential of the process to pilot-scale will be investigated.