Zeng, An-PingAn-PingZeng11381282790000-0001-9768-7096Arbter, PhilippPhilippArbter2022-10-102022-10-102022Technische Universität Hamburg (2022)http://hdl.handle.net/11420/13724Die Elektrobiotechnologie ist eine vielversprechende Plattformtechnologie. Es wird davon ausgegangen, dass sie bei der Transformation des aktuell erdöl-basierten Wirtschaftssystems hin zur nachhaltigen und zirkulären Bioökonomie eine Schlüsselrolle einnehmen wird. In diesem Zusammenhang beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Einfluss der Elektrochemie auf zwei Bioprozesse: die mikrobielle Herstellung von Lipiden durch die Hefe Rhodosporidium toruloides und die Produktion von 1,3-Propandiol (PDO) und n-Butanol durch das anaerobe Bakterium Clostridium pasteurianum. Einen Schwerpunkt bildet hierbei der Einsatz von metabolomischen und systembiologischen Methoden. Dies erlaubt eine zuverlässige und quantitative Beschreibung des Einflusses der Elektrochemie auf den mikrobiellen Stoffwechsel. Generell wurde in vorherigen Arbeiten gezeigt, dass die Elektrofermentation den positivsten Einfluss auf einen Bioprozess hat, wenn Mikroorganismen dazu in der Lage sind Elektronen aus einer Stromquelle aufzunehmen und physiologisch nutzbar zu machen. Weitere Studien legen aber auch nahe, dass die Elektrofermentation ebenfalls einen positiven Einfluss haben kann, wenn die Mikroorganismen die zur Verfügung gestellten Elektronen nicht direkt aufnehmen können. Hierbei dient die Elektrizität dann dazu Prozessparameter, insbesondere das Redoxpotential, künstlich zu beeinflussen. Folglich kann die Elektrofermentation auch indirekt zur Verbesserung von Bioprozessen beitragen. Besonderes Augenmerk dieser Arbeit liegt deshalb auf der Evaluierung der Eignung von Elektrizität zur Manipulation und Kontrolle des Redoxpotentials von Fermentationsbrühen und den hieraus resultierenden Effekten auf die Mikroorganismen und den Bioprozess. Für die Lipidproduktion mit R. toruloides konnte durch eine Elementarmodenanalyse gezeigt werden, dass das zur Verfügung stellen von substratunabhängigen Elektronen die Lipidausbeuten, abhängig von der Kohlenstoffquelle, theoretisch um maximal 29% steigern kann. Dies ist jedoch nur der Fall, wenn der Stamm direkt Elektronen von der eingesetzten Elektrode in die Zellen aufnehmen kann und gleichzeitig auch Protonen ins Cytosol transportiert werden. Satzkultivierungen zeigten, dass sich das Redoxpotential, selbst unter aeroben Bedingungen (pO2 = 50%), elektrochemisch um bis zu -600 mV herabsetzten lässt und damit eine Steigerung der Lipidausbeute einhergeht. Eine weitere interessante experimentelle Beobachtung betrifft den Sättigungsgrad der produzierten Lipide: Der Einsatz von Elektrizität, bei gleichzeitiger Hinzugabe des Redoxmediators Neutralrot, führte zu einer Steigerung des Anteils von gesättigten Fettsäuren auf über 50%. Die experimentellen Studien mit C. pasteurianum zeigten, dass der Stamm nicht elektroaktiv ist, d.h. er kann keine Elektronen direkt aufnehmen. Dennoch reagiert der Stamm aber auf die elektrochemische Änderung des Redoxpotentials und produzierte im Verhältnis mehr n-Butanol als PDO. Hierbei konnte eine mehr als vierfache Erhöhung des intrazellulären NADH/NAD-Verhältnisses in kathodischen bioelektrischen Systemen nachgewiesen werden, was die Aktivierung von reduktiven Stoffwechselwegen zur Folge hatte. Zusätzlich wurden kontinuierliche Fermentationen durchgeführt, in denen das Redoxpotential bei fester Verdünnungsrate elektrochemisch geregelt wurde. Hierdurch konnte bei einer Verdünnungsrate von 0.1 h-1 die molare Produktausbeute für PDO durch eine Anhebung des Redoxpotentials um maximal 57% erhöht werden. Gleichzeitig führte die Redoxregelung jedoch auch zur elektrochemischen Produktion von O2 im Bioreaktor, wodurch die enzymatiche Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA signifikant gehemmt wurde. Dies führte zu einer starken Abnahme der Substrataufnahme und Biomassekonzentration, was insgesamt in einer geringeren Raum-Zeit-Ausbeute für n-Butanol und PDO resultierte. Die Ergebnisse der Stoffflussanalyse weisen zudem darauf hin, dass C. pasteurianum, neben der Substratkettenphosphorylierung, weitere zelluläre Energiegewinnungsmechanismen besitzt und nutzt, die durch die Schaffung eines Protonengradienten mittels intrazellulärer Hydrogenasen angetrieben werden.Electrobiotechnology is a promising platform technology. The technology is expected to play a vital role in transforming the current oil-based economic system towards a sustainable and circular bioeconomy. Accordingly, this thesis deals with the influence of electro-fermentation on two bioprocesses: the microbial production of lipids by the yeast Rhodosporidium toruloides and the production of 1,3-propanediol (PDO) and n-butanol by the anaerobic bacterium Clostridium pasteurianum. In this context, metabolomics and methods from the field of systems biology are applied. This allows a reliable and quantitative description of the electricity's influence on microbial metabolism. In general, previous work has revealed that electro-fermentation has the most positive influence on a bioprocess when microorganisms can harvest electrons from a power source and make them physiologically accessible. However, other experimental studies suggest that electro-fermentation can also positively influence process performance, even if the microorganisms cannot directly take up artificially supplied electrons. In this case, the electricity is used to manipulate process parameters, in particular the oxidation-reduction redox potential (ORP). In this way, electro-fermentation can also contribute indirectly to improve the performance of bioprocesses. Hence, this work mainly focuses on evaluating the suitability of electricity for altering and controlling the fermentation broth’s ORP and the resulting effects on the microorganisms and the bioprocess. For lipid production with R. toruloides, it could be shown by elementary mode analysis that the application of electricity can theoretically increase lipid yields by a maximum of 29%, depending on the carbon source. However, this is only the case if the strain can directly harvest electrons from the electrode and simultaneously also transports protons into the cytosol. Batch cultivations showed that the ORP can, even at strictly aerobic conditions (pO2 = 50%), be reduced electrochemically by up to -600 mV. This coincided with an increase in observed lipid yields. Another interesting experimental observation concerns the degree of saturation of the lipids produced: the use of electricity with the simultaneous addition of the redox mediator neutral red led to an increase in the proportion of saturated fatty acids to more than 50%. The experimental studies with C. pasteurianum showed that the strain is not electroactive, e.g. it cannot harvest electrode-derived electrons in measurable quantities directly. Nevertheless, in fed-batch fermentations, the strain reacted to the electrochemical alteration of the ORP and produced proportionally more n-butanol than PDO. A more than four-fold increase in the intracellular NADH/NAD ratio in cathodic bioelectrical systems was observed, which resulted in the activation of reductive metabolic pathways. In addition, continuous fermentations were carried out, in which the ORP was controlled electrochemically to desired set-points at fixed dilution rate. Here, the molar product yield for PDO could be maximally improved by 57% by increasing the ORP at a dilution rate of 0.1 h-1. At the same time, however, the ORP control also led to the electrochemical production of oxygen in the bioreactor, which significantly inhibited the conversion of pyruvate to acetyl-CoA. This led to a substantial decrease in substrate uptake and biomass concentration, which resulted in a lower space-time yield for n-butanol and PDO. Furthermore, the metabolic flux analysis results indicate that C. pasteurianum possesses and uses other cellular energy generation mechanisms in addition to substrate-chain phosphorylation. The data suggest that this newly discovered mechanism for C. pasteurianum might be driven by the creation of a proton gradient with the help of intracellular hydrogenases.enhttps://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/Biowissenschaften, BiologieTechnikDoctoral Thesis10.15480/882.462110.15480/882.4621Holtmann, DirkDirkHoltmannOther