Liese, AndreasAndreasLiese12031830X0000-0002-4867-9935Hennecke, LeonLeonHennecke2024-06-252024-06-252024Technische Universität Hamburg (2024)https://hdl.handle.net/11420/48032Kinetic model identification is important for the optimization and scale-up of enzymatic processes. The modelling process is strongly influenced by human error, experimental design and model selection, which can be overcome by automation. Therefore, in this work, an automated reactor platform has been developed to perform kinetic model identification for a model enzymatic reaction. This reaction is catalyzed by a formate dehydrogenase from the yeast Candida boidinii. The reduction of NAD+ to NADH with the hydride donor sodium formate is monitored by inline UV/Vis spectroscopy at 340 nm in the design space of 0.35 to 2 mM NAD+ and 50 to 300 mM formate. The enzyme is utilized in a packed bed reactor, where it is immobilized on functionalized porous resin particles. The steady-state concentration of NADH is measured to determine the corresponding reaction rate at various initial substrate concentrations, providing data for identifying a kinetic model from eight candidate models. These kinetic models serve as the basis for a model-based design of experiments using the Akaike weight design criterion. This method uses Akaike weights to measure the relative goodness of fit for candidate models and identify experiments with maximum information content. Once a successful model discrimination is achieved, parameter estimation is improved through additional experiments according to the e-optimal design criterion to reduce the confidence intervals of the model parameters of the discriminated kinetic model. The model identification process is based on six fully factorial designed experiments initially, which is then improved through nine additional experiments. This approach leads to the discovery of a kinetic model within 15 experiments, with standard deviations of less than 10% within the range of measurement error. The double substrate Michaelis-Menten model accurately represented the packed bed reactor data after implementing a multi-start heuristic and extending the design space. The kinetic model identification was optimized and applied to data from an enzyme membrane reactor process with formate dehydrogenase in solution. The resulting model showed non-competitive product inhibition, in contrast to the model for the immobilized enzyme. The reactor configuration and immobilization resulted in a distinct kinetic model and confidence intervals. This emphasizes the impact of experimental design on identifying kinetic models and the advantages of automation in this field.Die Identifizierung von kinetischen Modellen ist wichtig für die Optimierung und das Scale-up von enzymatischen Prozessen. Um den Einfluss des menschlichen Fehlers, der Versuchsplanung und der Modellauswahl zu minimieren, wurde in dieser Arbeit eine automatisierte Reaktorplattform entwickelt, um die kinetische Modellidentifizierung für eine enzymatische Modellreaktion durchzuführen. Die Reduktion von NAD+ zu NADH mit dem Hydriddonator Natriumformiat wird durch eine Formiatdehydrogenase aus der Hefe Candida boidinii katalysiert. Die Reaktion wird im Konzentrationsbereich von 0,35 bis 2 mM NAD+ und 50 bis 300 mM Formiat durch Inline-UV/Vis-Spektroskopie bei 340 nm verfolgt. Das Enzym ist auf funktionalisierten porösen Harzpartikeln immobilisiert und wird in einem Festbettreaktor verwendet. Die stationäre NADHKonzentration wird gemessen, um die entsprechende Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen anfänglichen Substratkonzentrationen zu bestimmen. Die daraus resultierenden Daten dienen zur Identifizierung eines kinetischen Modells aus acht möglichen Modellen, die die Grundlage für eine modellbasierte Versuchsplanung unter Verwendung des Akaike-Gewichtskriteriums bilden. Bei dieser Methode werden Akaike-Gewichte verwendet, um die relative Anpassungsgüte von Modellkandidaten zu messen und Experimente mit maximalem Informationsgehalt zu ermitteln. Sobald eine erfolgreiche Modelldiskriminierung erreicht ist, wird die Parameterschätzung durch zusätzliche Experimente gemäß dem e-optimalen Designkriterium verbessert, um die Konfidenzintervalle der Modellparameter des diskriminierten kinetischen Modells zu reduzieren. Der Prozess zur Identifizierung des Modells basiert zunächst auf sechs Experimenten eines vollständigen Versuchsplans. Anschließend werden neun optimierte Experimente durchgeführt, um das Modell zu verbessern. Dieser Ansatz führt zur Entdeckung eines kinetischen Modells innerhalb von 15 Experimenten. Die Standardabweichungen liegen dabei innerhalb des Messfehlerbereichs und betragen weniger als 10%. Das Doppelsubstrat-Michaelis-Menten-Modell repräsentiert die Daten des Festbettreaktors mit der höchsten Genauigkeit, nachdem eine Mehrfachstart-Heuristik implementiert und der Designraum erweitert wurde. Die Identifizierung des kinetischen Modells wurde optimiert und auf die Daten eines Enzym-Membranreaktorprozesses mit Formiatdehydrogenase in Lösung angewendet. Das resultierende Modell zeigte eine nicht-kompetitive Produkthemmung, im Gegensatz zum Modell für das immobilisierte Enzym. Die Reaktorkonfiguration und die Immobilisierung führten zu einem unterschiedlichen kinetischen Modell und Vertrauensintervall. Die produzierten Ergebnisse betonen die Bedeutung der Versuchsplanung für die Identifizierung kinetischer Modelle und die Vorteile der Automatisierung in diesem Bereich.enhttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/automationEnzyme kineticsimmobilized biocatalysismodel-based design of experimentsNatural Sciences and Mathematics::572: BiochemistryDoctoral Thesis10.15480/882.1309010.15480/882.13090Schlüter, MichaelMichaelSchlüter10.15480/882.9427Other