Zeng, An-PingAn-PingZeng11381282790000-0001-9768-7096Mora Villalobos, José AníbalJosé AníbalMora Villalobos2018-06-152018-06-152018http://tubdok.tub.tuhh.de/handle/11420/1688Metabolic Engineering hat in den letzten zwei Jahrzehnten erhebliche Verbesserungen der Produktion von Tryptophan in E. coli ermöglicht und somit zahlreiche Möglichkeiten für die Produktion von Tryptophan-Derivaten eröffnet. 5-Hydroxy-tryptophan (5HTP) und Serotonin sind zwei wichtige Beispiele hierfür, welche nicht nur im Hinblick auf ihren pharmazeutischen Wert bedeutend sind, sondern auch als Vorläufer anderer Moleküle dienen können. Hierzu gehören unter anderem Schlafzyklusregulatoren, Antimigräne-Medikamente, Sedativa, Antikonvulsiva, Medikamente zur Tumorbekämpfung, antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel und viele weitere mehr. Gegenwärtig wird 5HTP hauptsächlich durch Extraktion aus der Pflanze Griffonia simplicifolia gewonnen; Serotonin wird durch chemische Synthese hergestellt. In beiden Fällen werden organische Lösungsmittel und hohe Temperaturen benötigt. Außerdem beginnt im Falle von Serotonin die chemische Synthese bei einem komplexen Molekül (5-Benzyloxyindol). Daher ist ein einfaches biotechnologisches Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen erwünscht. Diese Dissertation umfasst die Arbeiten hinsichtlich der Erweiterung des Tryptophan-Metabolismus‘ für die Produktion von 5HTP und Serotonin. Zu diesem Zweck wurde die Serotoninproduktion via Tryptamin oder 5HTP verglichen und analysiert. In beiden Fällen schien der Hydroxylierungsschritt einen Engpass darzustellen, da die Enzyme geringe Aktivität aufwiesen, wenn sie in E. coli exprimiert wurden. Ein weiterer Aspekt war die Notwendigkeit eines Kofaktors und eines entsprechenden Regenerations¬wegs. Die Entscheidung fiel zugunsten des Serotonin-Produktionsweg via 5HTP. Hierfür wurde eine aromatische Aminosäure-Hydroxylase aus Cupriavidus taiwanensis (CtAAAH) unter Verwendung eines in silico strukturbasierten Ansatzes ausgewählt. Mehrere substratpräferenzbestimmende Aminosäurereste wurden unter Verwendung von Sequenz-, phylogenetischer und funktioneller Divergenzanalyse vorhergesagt und ausgewählt. Ganzzellanalysen wurden mit dem Wildtyp und den Mutanten durchgeführt, um die Verschiebung der Enzympräferenz von Phenylalanin hin zu Tryptophan zu untersuchen. Alle Varianten erhöhten die Hydroxylierungsaktivität von Tryptophan zuungunsten von Phenylalanin. Die beste Variante, CtAAAH-W192F, wurde in einen Stamm mit inaktiviertem tryptophanase A-Gen und einem menschlichen Tetrahydrobiopterin (BH4)-Regenera-tions¬weg transformiert. Der resultierende Stamm war in der Lage, 2,5 mM 5HTP nach 24 Stunden in Medium mit Tryptophan zu synthetisieren. Nach dieser ersten rationalen Entwurfsrunde wurde ein zweiter semi-rationaler Ansatz ausgewählt, um die Effizienz des Enzyms zu verbessern. Ein intra-zellulärer Tryptophan-Konzentrationssensor wurde verwendet, um zwei unabhängige Varianten-sammlungen (Library) zu durchsuchen. Die besten Varianten aus jeder Library wurden kombiniert, um CtAAAH-LC zu erzeugen. Diese Doppelmutante zeigte eine erhöhte Aktivität und Reaktions-geschwindigkeit als ihr Vorgänger. CtAAAH-LC wurde in einen Tryptophan-Produzentenstamm (S028) mit zuvor hinzugefügtem Pterin-Regenerationsweg transformiert (Pterin ist ein Kofaktor, der während der Hydroxylierung verbraucht wird). In diesem Fall wurde 5HTP aus Glukose synthetisiert. Tryptophan-Decarboxylase (TDC) wurde in den 5HTP-Produzentenstamm eingebaut, um Serotonin aus Glukose zu erzeugen. Allerdings war die Serotoninproduktion niedrig und es wurden unerwünschte Nebenreaktionen identifiziert. Ein zweistufiges System wurde entwickelt, um dieses Problem zu überwinden. Hierdurch wurden die 5HTP-Produktion und die Serotonin-Umwandlung voneinander getrennt. In dieser Arbeit werden Ergebnisse mit der bisher höchsten berichteten biotechnologisch hergestellten Konzentration von 5HTP gezeigt. Zu diesem Zweck wurde Protein-Engineering an CtAAAH durchgeführt und ein neuer Syntheseweg in E. coli implementiert. Anschließend wurde Serotonin mittels Decarboxy-lierung von 5HTP in einer zweiten Fermentation produziert. Dies ist der erste Bericht einer Serotoninproduktion aus Glukose. Das Verfahren kann durch Kombination der Hydroxylierungs- und Decarboxylierungsreaktion in einem Stamm weiter optimiert werden. Die TDC-Selektivität kann in Richtung 5HTP zuungunsten von Tryptophan verschoben werden. Hierfür ist die Entwicklung eines neuen 5HTP-sensitiven Biosensors entscheidend.Metabolic engineering has improved the production of tryptophan in E. coli during the last two decades, opening itself a plethora of opportunities for the production of tryptophan derivatives. 5-Hydroxytryptophan (5HTP) and serotonin are two important derivatives not only important for their pharmaceutical value but also because they could serve as a precursor of other molecules which includes sleep cycle regulator, anti-migraine medications, sedatives, anticonvulsants, antitumors, antimicrobials, antivirals, among others. To the present, 5HTP is mainly obtained by extraction from the plant Griffonia simplicifolia and serotonin is produced by chemical synthesis. In both cases, the processes involve the use of organic solvents and high temperature during the procedure. Moreover, in the case of serotonin, its chemical synthesis starts from a complex molecule (5-benzyloxyindole). A simple biotechnological method for the production of these compounds is desired. This dissertation presents the work done in the extension of the tryptophan metabolism for the production of 5HTP and serotonin. For this purpose, serotonin production via tryptamine and via 5HTP were compared and analyzed. In both cases, the hydroxylation step seemed to be the bottleneck due to the low activity of the enzymes when expressed in E. coli and the requirement of a cofactor, plus its regeneration pathway. The serotonin production pathway via 5HTP was chosen, and for this purpose, an aromatic amino acid hydroxylase from Cupriavidus taiwanensis (CtAAAH) was selected using an in silico structure-based approach. Several substrate-determining residues were predicted and selected using sequence, phylogenetic and functional divergence analyses. Whole cells analysis with the wild-type and variants were done to study the shift of the enzyme preference from phenylalanine to tryptophan. All the variants increased the tryptophan hydroxylation activity in detriment to phenylalanine. The best performer, CtAAAH-W192F, was transformed into a strain that had the tryptophanase A gene disrupted and carried a human tetrahydrobiopterin (BH4) regeneration pathway. The resulting strain was capable of synthesizing 2.5 mM 5HTP after 24 hours in medium supplied with tryptophan. After this first rational design round, a second semi-rational approach was selected to improve the efficiency of the enzyme. A tryptophan intracellular concentration sensor was used to screen two independent libraries, and the variants found in the best performer of each library were combined to create CtAAAH-LC. This double mutant showed higher activity and reaction velocity than its predecessor. CtAAAH-LC was transformed into a tryptophan producer strain (S028), which had been previously modified by the addition of a pterin (a cofactor that is consumed during hydroxylation) regeneration pathway. In this case, 5HTP was synthesized from glucose. Tryptophan decarboxylase (TDC) was incorporated in the 5HTP producer strain to produce serotonin from glucose. However, the serotonin production was low and undesired side reactions were identified. To circumvent this problem, a two-step system was constructed in which the 5HTP production and the serotonin conversion are separated. In this work, results of the highest biotechnologically produced concentration of 5HTP reported so far are presented, for this purpose protein engineering was done in CtAAAH and a synthetic pathway was incorporated in E. coli. Afterwards, 5HTP was decarboxylated to produce serotonin in a second fermentation. This is the first report of serotonin production from glucose. Still, the process can be further optimized by combining the hydroxylation and decarboxylation reaction in one strain. TDC selectivity can be engineered to shift the preference toward 5HTP in detriment of tryptophan. In this case, the development of a novel biosensor sensitive to 5HTP is critical for selection.enhttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/protein engineeringmetabolic engineering5-hydroxytryptophansynthetic biologySerotoninMedizinDoctoral Thesisurn:nbn:de:gbv:830-8822139610.15480/882.168511420/168810.15480/882.1685Liese, AndreasAndreasLieseOther