Liese, AndreasAndreasLiese12031830X0000-0002-4867-9935Sayoga, Giovanni VallianGiovanni VallianSayoga2025-10-202025-10-202025Technische Universtität Hamburg (2025)https://hdl.handle.net/11420/57981Hydrogen peroxide (H2O2) is an environmentally safe chemical and widely employed as a co-substrate in biocatalytic processes. Among various enzymes that are capable of utilizing H2O2 as a co-substrate, the recombinant unspecific peroxygenase from the fungus Agrocybe aegerita (rAaeUPO) stands out as the favorite due to its stability and versatility. Nevertheless, the technical application and combination of rAaeUPO and H2O2 in the biotechnological field remains challenging. This is due to the toxicity of H2O2 towards biocatalysts and the inactivation of rAaeUPO at an elevated concentration of H2O2. The precise dosing of H2O2 is of great importance, yet very challenging. A number of strategies have been explored to mitigate the deactivation effect of H2O2. Thus far, they have been largely deemed unsatisfactory due to the dilution effect or formation of complex by-products. An electrochemical approach represents an attractive method that provides controllable in situ generation of H2O2. The objective of this dissertation is to develop a fully controllable system for the electrochemical in situ generation of H2O2, designed as an optimizable platform for H2O2-dependent enzymatic reactions and to promote catalyst efficiency. To address these challenges, the All-in-One (AiO) electrode system was employed for the in situ generation of H2O2. This concept was integrated with the enzymatic hydroxylation, catalyzed by rAaeUPO, to establish a bioelectrochemical system (BES). The maximum H2O2 productivity and Faradaic efficiency achieved in the AiO electrode system were 0.87 µM min-1 cm-2 and 60%, respectively. The application of the AiO electrode within the BES yielded promising results, achieving a total turnover number (TTN) of 450,000 mol mol-1 and a turnover frequency (TOF) of 7.7 s-1. By incorporating aeration and increasing the number of electrodes, the specific surface area was enhanced, resulting in an increase in both TTN and TOF up to 700,000 mol mol-1 and 20.1 s-1, respectively, with a productivity of 1.3 g L-1 d-1. Although H2O2 productivity was identified as the limiting factor, the system demonstrated considerable potential for optimization through surface modification of the electrode. Moreover, this dissertation compared two modes of in situ H2O2 electrogeneration: the conventional galvanostatic mode and the H2O2-stat mode. The two modes were tested within the gas diffusion electrode system, employing the identical enzymatic reaction. While the galvanostatic mode demonstrated a maximum H2O2 productivity of 5.5 µM min-1 cm-2 and a productivity of 10.5 g L-1 d-1 at 6.4 mA cm-2, the H2O2-stat mode, particularly at a H2O2 concentration limit of 0.2 mM, yielded favorable outcomes with a TTN of 655,000 mol mol-1, a TOF of 80.3 s-1, and a productivity of 6.1 g L-1 d-1. The successful application of the H2O2-stat mode highlights its potential as a more effective alternative to the galvanostatic approach, significantly enhancing the process performance of rAaeUPO and advancing the field of enzymatic electrosynthesis.Wasserstoffperoxid (H2O2) findet häufig Verwendung als Co-Substrat in biokatalytischen Prozessen. Die rekombinante unspezifische Peroxygenase aus Agrocybe aegerita (rAaeUPO) weist eine hohe Stabilität sowie Vielseitigkeit auf und erscheint daher vielversprechend für technische Anwendungen in Kombination mit H2O2. Allerdings bleibt die technische Anwendung von rAaeUPO mit H2O2 bislang eine Herausforderung. Die Toxizität von H2O2 sowie die Inaktivierung von rAaeUPO bei höheren H2O2 Konzentrationen stellen wesentliche Herausforderungen dar. Bisherige Strategien zur Minderung dieser Effekte erweisen sich als unzureichend. Ein elektrochemischer Ansatz zur kontrollierten in situ Erzeugung von H2O2 könnte eine effektive Lösung bieten. Das Ziel dieser Dissertation ist es, ein vollständig kontrollierbares System zur elektrochemischen in situ Erzeugung von H2O2 zu entwickeln, das als optimierbare Plattform für H2O2-abhängige enzymatische Reaktionen konzipiert ist und die Katalysatoreffizienz steigern soll. Um die genannten Herausforderungen zu bewältigen, wurde das All-in-One (AiO) Elektroden-System für die in situ Erzeugung von H2O2 eingesetzt. Dieses Konzept wurde mit der enzymatischen Hydroxylierung, katalysiert durch die rAaeUPO, integriert, um ein bioelektrochemisches System (BES) zu etablieren. Die maximale H2O2-Produktivität und Faradaische Effizienz, die im AiO-Elektrodensystem erreicht wurden, betrugen 0,87 µM min-1 cm-2 und 60%. Der Einsatz der AiO-Elektrode im BES ergab vielversprechende Ergebnisse, mit einer total turnover number (TTN) von 450.000 mol mol-1 und einer turnover frequency (TOF) von 7,7 s-1. Durch die Integration der Begasung und die Erhöhung der Anzahl der Elektroden wurde die spezifische Oberfläche vergrößert, was zu einer Steigerung von TTN und TOF auf bis zu 700.000 mol mol-1 und 20,1 s-1 führte, bei einer Produktivität von 1,3 g L-1 d-1. Obwohl die H2O2-Produktivität als limitierender Faktor identifiziert wurde, zeigte das System ein beträchtliches Optimierungspotenzial durch Modifikation der Elektrodenoberfläche. Darüber hinaus verglich diese Dissertation zwei Modi der in situ H2O2-Elektrogenerierung: den konventionellen galvanostatischen Modus und den H2O2-stat Modus. Die beiden Modi wurden im Gasdiffusionselektrodensystem getestet, wobei die identische enzymatische Reaktion eingesetzt wurde. Während der galvanostatische Modus eine maximale H2O2-Produktivität von 5,5 µM min-1 cm-2 und eine Produktivität von 10,5 g L-1 d-1 bei 6,4 mA cm-2 aufwies, lieferte der H2O2-stat Modus, insbesondere bei einer H2O2-Konzentrationsgrenze von 0,2 mM, vorteilhaftere Ergebnisse mit einer TTN von 655.000 mol mol-1, einer TOF von 80,3 s-1 und einer Produktivität von 6,1 g L-1 d-1. Die erfolgreiche Anwendung des H2O2-stat Modus unterstreicht sein Potenzial als effektivere Alternative zum galvanostatischen Ansatz, was die Prozessleistung der rAaeUPO erheblich verbessert und das Feld der enzymatische Elektrosynthese voranbringt.enhttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Hydrogen peroxideUnspecific peroxygenaseEnzyme catalysisBioelectrochemical systemElectrochemistryNatural Sciences and Mathematics::541: Physical; Theoretical::541.3: Physical Chemistry::541.37: ElectrochemistryNatural Sciences and Mathematics::572: BiochemistryDoctoral Thesishttps://doi.org/10.15480/882.1598610.15480/882.15986Heins, Anna-LenaAnna-LenaHeinsOther