Gescher, JohannesJohannesGescher1302114510000-0002-1625-8810Fritz, BenjaminBenjaminFritz2026-06-172026-06-172026Technische Universtiät Hamburg (2026)https://hdl.handle.net/11420/63559The facultative anaerobe Shewanella oneidensis is a model organism widely studied for its extracellular electron transfer capabilities, making it a promising candidate for bioelectrochemical systems (BES). However, its presumed genetic instability presents a key challenge, particularly for long-term industrial applications. This study investigates two major factors influencing genetic robustness in S. oneidensis: transposon activity and the presence of the megaplasmid (MP). Transposable elements (TEs) play a crucial role in genome plasticity. Their high activity can lead to disruptive mutations, compromising strain stability. To assess transposase mobility under TE-activating conditions, transcriptomic analysis and stress-induced transposition experiments were combined with whole-genome sequencing. The results indicate that certain insertion sequences (IS), particularly ISSOD1, ISSOD2 and ISSOD9, exhibit high transposition rates, contributing to genetic instability. To mitigate these effects, CRISPR-Cas-deaminase-based genome editing was employed to introduce premature stop codons into active transposase genes. This deactivation successfully reduced transposase-related mutations emanating from the ISSOD2 family, demonstrating a viable strategy for stabilizing the S. oneidensis genome. ISSOD9 activity appeared to be strongly linked to the presence of plasmids in transformed strains, suggesting its transposition mechanism is associated with horizontal gene transfer. This finding has significant implications for studies utilizing external plasmids, as it underscores the potential for unintended genomic alterations. In parallel, the role of the megaplasmid in genetic stability was examined, which harbors numerous TEs and contains mutation-prone regions, increasing TE motility potential. Using an adaptive evolutionary approach, it was attempted to delete the MP while circumventing post-segregational killing caused by toxin-antitoxin pairs that contribute to stabilized vertical plasmid transfer. Although complete megaplasmid loss was not achieved, approximately 35 % of its sequence was deleted, including nine TEs and an identified hotspot for integration. Notably, the unexpected loss of the region containing the origin of replication suggests a metastable state for the MP. By integrating genome-wide analyses with targeted genetic modifications, this study provides valuable insights into the mechanisms governing genetic stability in S. oneidensis. These findings contribute to optimizing S. oneidensis as a robust production strain for BES applications, with broader implications for microbial engineering and industrial biotechnology.Das fakultativ anaerobe Bakterium Shewanella oneidensis ist ein Modellorganismus, der aufgrund seiner Fähigkeit zum extrazellulären Elektronentransfer intensiv untersucht wird und daher als vielversprechender Kandidat für bioelektrochemische Systeme (BES) gilt. Eine wesentliche Herausforderung für den langfristigen industriellen Einsatz stellt jedoch seine vermutete genetische Instabilität dar. In dieser Arbeit wurden zwei Hauptfaktoren untersucht, die die genetische Stabilität von S. oneidensis beeinflussen: die Aktivität transponierbarer Elemente sowie das Vorhandensein des Megaplasmids (MP). Transponierbare Elemente (TEs) spielen eine zentrale Rolle für die Plastizität bakterieller Genome. Eine hohe Aktivität dieser Elemente kann zu störenden Mutationen führen und dadurch die Stabilität eines Stammes beeinträchtigen. Um die Mobilität von Transposasen unter TE-aktivierenden Bedingungen zu untersuchen, wurden transkriptomische Analysen sowie stressinduzierte Transpositionsexperimente mit Ganzgenomsequenzierungen kombiniert. Die Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Insertionselemente (IS), insbesondere ISSOD1, ISSOD2 und ISSOD9, hohe Transpositionsraten aufweisen und somit zur genetischen Instabilität beitragen. Zur Verringerung dieser Effekte wurde ein CRISPR-Cas-Deaminase-basiertes Genome-Editing-Verfahren eingesetzt, um vorzeitige Stoppcodons in aktive Transposasegene einzuführen. Durch diese Inaktivierung konnten Transposase-vermittelte Mutationen der ISSOD2-Familie erfolgreich reduziert werden, was eine vielversprechende Strategie zur Stabilisierung des Genoms von S. oneidensis darstellt. Die Aktivität von ISSOD9 schien hingegen eng mit dem Vorhandensein von Plasmiden in transformierten Stämmen verknüpft zu sein, was darauf hindeutet, dass sein Transpositionsmechanismus mit horizontalem Gentransfer assoziiert ist. Diese Beobachtung besitzt erhebliche Relevanz für Studien, die externe Plasmide verwenden, da sie das Potenzial unbeabsichtigter genomischer Veränderungen verdeutlicht. Parallel dazu wurde die Rolle des Megaplasmids für die genetische Stabilität untersucht. Das Megaplasmid beherbergt zahlreiche transponierbare Elemente und enthält mutationsanfällige Regionen, die die Mobilität dieser Elemente begünstigen können. Mithilfe eines adaptiven Evolutionsansatzes wurde versucht, das Megaplasmid zu eliminieren und dabei die durch Toxin-Antitoxin-Systeme verursachte post-segregationale Abtötung zu umgehen, welche zur Stabilisierung der vertikalen Plasmidvererbung beiträgt. Obwohl eine vollständige Entfernung des Megaplasmids nicht erreicht werden konnte, wurden etwa 35 % seiner Sequenz deletiert, darunter neun transponierbare Elemente sowie ein identifizierter Integrations-Hotspot. Bemerkenswert war der unerwartete Verlust der Region, die den Replikationsursprung enthält, was auf einen metastabilen Zustand des Megaplasmids hindeutet. Durch die Kombination genomweiter Analysen mit gezielten genetischen Modifikationen liefert diese Arbeit wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die die genetische Stabilität von S. oneidensis bestimmen. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zur Optimierung von S. oneidensis als robuste Produktionsplattform für bioelektrochemische Systeme bei und besitzen darüber hinaus Bedeutung für das mikrobielle Engineering und die industrielle Biotechnologie.enhttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/SoneidensisCRISPR-CASTransposasesgenetic engineeringgeneticsNatural Sciences and Mathematics::579: Microorganisms, Fungi and AlgaeTechnology::660: Chemistry; Chemical Engineering::660.6: BiotechnologyDoctoral Thesishttps://doi.org/10.15480/882.1732710.15480/882.17327Heins, Anna-LenaAnna-LenaHeins