New approaches for characterizing and monitoring mammalian cell cycle and specific growth rate in production cell lines

Zeng, An-PingAn-PingZeng11381282790000-0001-9768-7096Fuge, GrischaGrischaFuge2018-02-282018-02-282018http://tubdok.tub.tuhh.de/handle/11420/1559Diese Studie befasst sich mit den verschiedenen mutmaßlichen wechselseitigen Abhängigkeiten zwischen dem Zellzyklus und dem Verhalten von Säugetierzelllinien, basierend auf einer kontrollierten und physiologischen Synchronisierungs- und Kultivierungsmethode mit minimaler Artefakt-Anfälligkeit, sowie den zugehörigen Implikationen für zuverlässige Prozessanalytik und -kontrolle. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine bereits vorab etablierte experimentelle Anordnung zur Erzeugung synchronisierter Suspensionskulturen auf die humane Suspensions-zelllinie Human Embryonic Kidney cell line 293s adaptiert. Diese konnte somit unter annähernd physiologischen Bedingungen synchronisiert werden. Es waren umfang-reiche Optimierungen nötig, um hohe Überlebensraten sowie aggregationsfreies Wachstum zu erreichen und beizubehalten. Im Folgenden wurde diese Technik für Studien genutzt, um die potentielle Abhängigkeit der Transfektionseffizienz vom Zeitpunkt der Transfektion relativ zum Zellzyklus zu untersuchen. Diese Studien basieren auf Synchronisationsmethoden unter annähernd physiologischen Bedingungen. Das folgende synchrone Wachstum konnte dabei durch DNA-basierte Zellzyklus-Analysen und Wachstumsraten-Analysen belegt werden. Die Resultate deuten darauf hin, dass die sogenannten Abhängigkeiten der Transfektionseffizienz von dem Zellzyklus, die von anderen Forschungsgruppen publiziert wurden, nicht bestätigt werden können, wenn annähernd-physiologisch synchronisierte Kulturen genutzt werden. Folglich ist wahrscheinlich, dass die bislang veröffentlichten mutmaßlichen Zellzyklus-Abhängigkeiten Artefakte der nicht-physiologischen Methoden sind, die in diesen Studien verwendet wurden. Es ist anzumerken, dass diese Studie keine Aussage über potentielle Zellzyklus-Abhängigkeiten der Produktionsraten trifft; diese bedürfen weiterer zukünftiger Untersuchungen, potentiell unter Nutzung der hier etablierten Methoden. Um daran anknüpfend weiterführende zellzyklus-spezifische Untersuchungen und darüber hinaus zukünftig Online-Messungen zu ermöglichen, wurde ein neuartiger Ansatz gewählt. Es wurden zwei neue Derivate der häufig genutzten Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) Produktionszelllinie erzeugt, die ihren Zellzyklus- sowie Wachstumszustand in einer on-line auslesbaren Weise mittels Fluoreszenz anzeigen. Zu diesem Zweck wurden drei genetische FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) Konstrukte in zwei verschiedenen Kombinationen verwendet. In Übereinstimmung mit der Originalnomenklatur von Miyawaki et al. [C: mKO2-hCdt1(30/120), M: mVenus-hGeminin(1/110) und N: mVenus-hGeminin(1/60)] werden diese bezeichnet als CHO-K1 FUCCI CM und CN. Um quantitative und reproduzierbare Aussagen, basierend auf den Fluoreszenzeigenschaften, treffen zu können, wurden die folgenden Parameter eingeführt: Der Parameter iredn gibt an, welcher Anteil [%] der Zellen rot fluoresziert und steht im Verhältnis zur Gesamtanzahl fluoreszierender Zellen, zusammengesetzt aus der Anzahl von Zellen mit roter und grüner Fluoreszenz. Dieser relative Parameter ist somit weitgehend unabhängig von eventuell schwankenden Gesamt-Fluoreszenzintensitäten pro Zelle. Quantitative Analysen haben gezeigt, dass iredn gut mit dem Zellzyklusstatus von Kulturen korreliert (ausgedrückt als Anteil [%] der Zellen in der G1 Phase) und darüber hinaus in direktem Zusammenhang zur Wachstumsrate (μ) steht. Der Parameter iredn besitzt daher eine hohe Aussagekraft, setzt aber auch voraus, dass die Fluoreszenz einzelner Zellen bestimmt werden kann, um deren Anzahl in ein quantitatives Verhältnis zu setzen, weshalb Durchflusszytometrie hier die Methode der Wahl ist. Analog dazu basiert der Parameter iredtotal auf den Gesamt-Fluoreszenz-Intensitäten der Kultur und ergibt sich aus der Gesamt-Intensität der roten Fluoreszenz zur Summe der Intensitäten von roter und grüner Fluoreszenz. Dieses relative Maß erlaubt eine große Robustheit gegenüber variablen Zelldichten bzw. Gesamt-Fluoreszenzintensitäten der Kultur. iredtotal wird somit bestimmt durch die Anzahl der Zellen in den verschiedenen Zellzyklus-Phasen sowie deren Fluoreszenz-Intensität pro Zelle. Entsprechend ist der Parameter iredtotal weniger exakt als iredn, kann jedoch auch mit einfacheren Methoden (Fluoreszenzphotometer, Online-Messung) bestimmt werden. Wichtig ist für beide genannten Ansätze, dass die Fluoreszenz-Intensitäten (rot vs. grün) mit ausreichender Spezifizität (also niedrigem Übersprechen zwischen den Farbkanälen) und Genauigkeit detektiert und quantifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass iredtotal genutzt werden kann, um Änderungen der Wachstumsrate und wachstumslimitierende Bedingungen, hier exemplarisch in der Form von L-Glutamin-Mangel, frühzeitig zu detektieren. Dies wurde in Schüttelkolben- sowie Bioreaktor-Kulturen bestätigt. So wurden signifikante Signale für eine entstehende Limitierung mehrere Stunden früher erkannt als mit herkömmlichen Methoden (Zellzahl, Sauerstoff-Aufnahme-Rate). Daher wird die Verwendung von on-line oder at-line Fluoreszenzsonden für weitere Analysen und Prozesskontrolle von Säugetierzellkulturen empfohlen.This study focuses on the different putative interdependencies between the cell cycle and the behaviour of mammalian production cell lines, based on a controlled physiological synchronization and cultivation method, as well as the corresponding implications for reliable process analysis and control. In the first part, an established experimental setup for the generation of synchronized suspension cultures was adapted for the Human Embryonic Kidney cell line 293. This cell line could then be synchronized under near-physiological conditions. Extensive optimisation efforts were required in order to achieve and maintain high viabilities as well as aggregation free growth. Subsequently, this method was used to examine the putative dependency of the transfection efficiency from the cell cycle state at the time of transfection. These studies are based on synchronization methods under near-physiological conditions. The following synchronized growth was confirmed by DNA based cell cycle analysis and specific growth rate determination. The results indicated that the so-called cell cycle dependencies reported by other groups, cannot be confirmed when near-physiological synchronised cultures are used. Hence it is likely that the putative cell cycle dependencies, which were reported before, are artefacts of the non-physiological synchronisation methods used in those studies. Note that this study doesn't draw conclusions concerning potential cell cycle dependencies of production rates; they require additional studies possibly utilizing the established methods described here. In order to facilitate the follow-up cell cycle specific research and future on-line measurements, a novel approach was chosen. Two new derivatives of the widely used Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) production cell line were established. They indicate their cell cycle as well as growth state in an on-line compatible manner by fluorescence. For this purpose, three different genetic FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) constructs were used in two different combinations. In coherence with the original nomenclature by Miyawaki et al. [C: mKO2-hCdt1(30/120), M: mVenus-hGeminin(1/110) and N: mVenus-hGeminin(1/60)] they were denoted CHO-K1 FUCCI CM und CN. In order to enable quantitative and reproducible conclusions based on the fluorescence properties, two quantitative parameters were introduced. The parameter iredn indicates the percentage of cells with red fluorescence in relation to the total number of fluorescent cells, composed of red and green fluorescent cells. This relative parameter is generally independent from possibly altering total fluorescence intensities per single cell. Quantitative analyses revealed that iredn correlates well with the cell cycle state (expressed as percentage of cells in the G1 cell cycle phase) and is furthermore directly connected to the specific growth rate (μ). Hence the parameter iredn has a high validity but requires measuring the fluorescence of single cells in order to calculate their numerical ratio. Therefore, flow cytometry is the method of choice. Correspondingly the parameter iredtotal is based on the total fluorescence intensity of the culture and is determined by the total red fluorescence in relation to the sum of total red and green fluorescence. This relative determination is robust with regard to variations in cell density and correspondingly changing total fluorescence intensities. Hence iredtotal is determined by the number of cells in the different cell cycle phases as well as the fluorescence intensity per cell. Consequently iredtotal is less exact compared to iredn but can be determined using simpler methods (fluorescence plate reader, online measurement). It is pivotal for both approaches to detect and quantify the fluorescence intensities (red vs. green) with sufficient specificity (low cross talk) and accuracy. It was demonstrated that iredtotal can be used to indicate changes in the growth behaviour as well as limiting growth conditions, here in the form of L-glutamine limitation, early on. This was confirmed in shaking flask and bioreactor cultures alike. Significant signals, indicating emerging limitation were detected several hours earlier compared to traditional indicators (cell counts, oxygen uptake rate). Ultimately, on-line or at-line fluorescent probes are highly recommended for further analyses and process control of mammalian cell cultures.enhttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/process controlbiotechnologycell culturefluorescenceFUCCIBiowissenschaften, BiologieNew approaches for characterizing and monitoring mammalian cell cycle and specific growth rate in production cell linesDoctoral Thesisurn:nbn:de:gbv:830-8821944710.15480/882.155611420/155910.15480/882.1556Reichl, UdoUdoReichlPhD Thesis