Morlock, MichaelMichaelMorlock1413094900000-0002-5330-2454Chang Liao, Mei-LingMei-LingChang Liao2014-12-022014-12-022014807094765http://tubdok.tub.tuhh.de/handle/11420/1207Die Initiierung und Übertragung von elektrischen Signalen spielen eine essentielle Rolle für die normale Herzfunktion. Diese werden von Kardiomyozyten, den funktionellen Bausteinen des Herzens, generiert und von einer zur nächsten Zelle und somit durch das gesamte Herz weitergeleitet. Die derzeitigen Methoden zur Untersuchung von elektrischer Aktivität in Kardiomyozyten und des gesamten Herzens über Elektroden und optische Kartierung beinhalten verschiedene Vor- und Nachteile. Beispielsweise liefern Aufnahmen mittels Mikroelektroden direkte und vertrauensvolle Einblicke über Änderungen von Stromfluss und Membranpotenzial von vereinzelten Zellen. Allerdings ist das experimentelle Vorgehen umständlich und invasiv, welches wiederholte Aufnahmen derselben Zelle zu unterschiedlichen Zeitpunkten verhindert. Optische Kartierungen mittels Fluoreszenzfarbstoffen weisen dahingegen eine höhere räumlich-zeitliche Auflösung auf. Jedoch sind diese Farbstoffe, obwohl nicht-invasiv, im Allgemeinen toxisch; zudem kann die Verteilung der Farbstoffe aufgrund der komplexen Gewebestruktur inhomogen ausfallen. Darüber hinaus stellen wiederholte, simultane Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten von vitalen Zellen bzw. Geweben eine technische Herausforderung dar, so dass Studien in vivo und über einen langen Zeitraum stark limitiert sind. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass das spannungssensitive fluoreszierende Protein VSFP2.3 zur Visualisierung von kardialer, elektrischer Erregung anwendbar ist. Über optogenetische Markierungen mittels VSFP2.3 sollen die obengenannten Defizite umgangen werden. VSFP2.3 kann in definierten Zelltypen stabil exprimiert werden, indem zellspezifische Promotorelemente verwendet werden, wobei das Protein permanent funktional bleibt. Dies kombiniert mit Bildgebung über Hochgeschwindigkeits- und hochsensitive Kameras wird longitudinale, nicht-invasive Studien ermöglichen. Zunächst wurde ein transgenes Mausmodell mit stabiler VSFP2.3-Expression unter der Kontrolle des kardial-spezifischen α-Myosin Heavy Chain (αMHC) Promotors etabliert. Das Transgen beeinträchtigte weder die Myokardstruktur noch die kardiale Funktion. Isolierte adulte Kardiomyozyten aus αMHCVSFP2.3-Mäuse wiesen eine deutliche Membranmarkierung auf. Elektrische Aktivitäten dieser Zellen und vom gesamten Herzen konnten zeitlich und räumlich hochaufgelöst optisch erfasst werden. Anschließend wurden doppelt-transgene induzierte pluripotente Stammzell-Linien (iPSC) generiert, die sowohl für das Neomycin-Resistenzgen (neoR) als auch für VSFP2.3 unter der Kontrolle des αMHC-Promotors kodierten: neoRVSFP-iPSC. Diese konnten erfolgreich zu spontan kontrahierenden Kardiomyozyten differenziert werden. Auch hier konnte nachgewiesen werden, dass sich VSFP2.3 in Herzmuskelzellen zur optischen Analyse der elektrischen Funktion eignet. Aus VSFP2.3 exprimierenden Herzmuskelzellen konnten schließlich spontan kontrahierende EHM (Engineered Heart Muscle) entwickelt werden. Auch in den EHMs konnten Fluoreszenzsignale erfolgreich aufgezeichnet werden. Zusammenfassend demonstriert die vorliegende Arbeit erstmalig die Anwendung eines genetisch kodierten Spannungssensors im Säugerherzen. Damit wird die nicht-invasive Beurteilung der elektrischen Aktivität in Herzmuskelzellen in vitro und in vivo mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung auch im longitudinalen Experiment möglich.The initiation and propagation of electrical signals play a pivotal role in normal cardiac function. These are carried out by cardiomyocytes, the building blocks of the heart, which generate and conduct electrical signal from one cell to another, throughout the whole heart. The techniques used for investigating electrical activities in cardiomyocytes and hearts, such as applying electrodes and optical mapping, possess different advantages and disadvantages. Microelectrode recordings, for example, provide direct and faithful insight into changes in the current and membrane potential from single cardiomyocytes. The experimental procedure, however, is laborious and invasive, which prevents repeated recordings on the same cells at different time points. Optical mapping using flourescent dyes offers a non-invasive technique with higher spatial-temporal resolution. However, the fluorescent dyes used are usually toxic, and the distribution of the dyes could be inhomogeneous due to the complex tissue structure. Moreover, repeated and simultaneous recordings at different time points in living cell/tissue are most challenging. Thus, in vivo and long-term applications are limited in the abovementioned set up. In this study, the hypothesis that a voltage sensitive fluorescent protein (VSFP2.3) is applicable for the visualization of cardiac excitability was tested. Optogenetic labeling with VSFP2.3 may overcome some of the aforementioned shortcomings. VSFP2.3 can be stably expressed in defined cell types by using cell type specific promoter elements, making it functional throughout lifetime. Combined with high speed and highly sensitive cameras, chronic studies in a noninvasive manner are feasible. Firstly, a transgenic mouse model stably expressing VSFP2.3 under the control of the cardiac specific alpha myosin heavy chain promoter (αMHC) was established. The transgene did not impair myocardial structure and cardiac function. Adult cardiomyocytes isolated from these transgenic mice showed clear membrane labeling of VSFP2.3. The electrical activities from single VSFP2.3 cardiomyocytes and whole hearts were optically recorded with high sensitive cameras and photomultipliers and validated the use of this approach. Secondly, double transgenic induced pluripotent stem cell (iPSC) lines carrying both neomycin resistant gene (neoR) and VSFP2.3 under the control of αMHC promoter were generated. NeoRVSFP iPSCs were differentiated into spontaneously beating cardiomyocytes. Changes in fluorescent signals were recorded from beating cardiomyocytes indicating the function of the protein. Engineered heart muscles (EHMs) generated from neoRVSFP iPSC-derived cardiomyocytes contracted spontaneously and responded to increasing extracellular calcium concentrations with an increase in force development. Fluorescent signals within EHMs were acquired successfully. Collectively, this study demonstrated for the first time that a genetically encoded voltage sensor expressed in the mammalian heart can serve as a means to precisely assess cardiomyocyte excitability.enhttp://doku.b.tu-harburg.de/doku/lic_ohne_pod.phpHerzgenetisch kodierte Spannungsanzeigeoptische BildgebungArrhythmiepluripotenten Stammzellenheartgenetically encoded voltage indicatoroptical imagingarrhythmiapluripotent stem cellsDoctoral Thesis2015-02-02urn:nbn:de:gbv:830-tubdok-1307510.15480/882.1205Kardiologie, AngiologieMedizintechnikHerzfunktionElektrisches SignalBilderzeugung11420/120710.15480/882.1205930768660PhD Thesis