Zeng, An-PingAn-PingZeng11381282790000-0001-9768-7096Minliang, ChenChenMinliang2020-12-172020-12-172020Dr. Hut (2020)http://hdl.handle.net/11420/8267In der Literatur wurden Mikroorganismen seit Jahren für die Produktion von L-Tryptophan (Trp) aus erneuerbaren Rohstoffen optimiert. Verschiedene Ansätze wurden dabei untersucht: die Anpassung der Genexpression sowie der Enzymkonzentration und die Abmilderung negativer regulatorischer Mechanismen. Hierbei wurde deutlich, dass die Entwicklung von effizienteren Trp-Produzenten ohne die umfassende Optimierung der zugehörigen Enzyme nicht möglich sein wird. Das Ziel dieser Arbeit ist folglich die Entwicklung von neuartigen in vivo Evolutions-, Screenings- und Charakterisierungsmethoden zur Optimierung von Enzymen der Trp-Synthese. Ein zuverlässiger in vivo Screening-Ansatz muss Mutationen mit dem Zellwachstum in Verbindung bringen können oder unscheinbare intrazelluläre Moleküle mit Biomarkern, wie etwa dem „enhanced green fluorescent protein“ (eGFP), koppeln. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde hierfür eine neuartige Genvarianten-Screening-Methode, die PGSS genannt wird (aus dem Englischen: Plasmid-assisted Growth-coupled and Sensor-guided in vivo Screening), entwickelt. Dieser Ansatz kombiniert die Vorteile von komplementären zell-autotroph-abhängigen Screenings mit biosensor-basierten in vivo Charakterisierungsmethoden. Die Effizienz von PGSS wurde hierbei zuerst bei der Verbesserung eines durch Anthranilat (ANTH) inhibierten Enzyms TrpC aus E. coli nachgewiesen, das aus der Glycerol-Phosphat-Synthase und der N-(5-phosphoribosyl) Anthranilat-Isomerase besteht. Ausgehend von einem Trp-auxotrophen Stamm S028ΔEctrpC konnte mit dem PGSS-Ansatz ein hocheffizienter ANTH-resistenter Kandidat EcTrpCS58Q-P59V-S60F-K61Q identifiziert werden. Anschließend wurde PGSS genutzt, um eine durch ANTH aktivierte TrpC-Variante von Aspergillus niger zu identifizieren (AnTrpC). Hieraus resultierte die Entdeckung einer weiteren Enzymvariante (AnTrpCR378F), die eine erhöhte Aktivierung durch ANTH besitzt. In anschließenden Fedbatch-Fermentationen konnte gezeigt werden, dass AnTrpCR378F in 51 h mehr Trp (35.36 g/L) als der Wildtyp AnTrpCWT (31.15 g/L) produzierte. Dies weist darauf hin, dass AnTrpCR378F in der Tat einen effizienteren Stoffwechsel zur Trp-Produktion besitzt. Um Limitierungen des Screenings zu überwinden, die aus der Durchführung unter nicht-repräsentativen Versuchsbedingungen resultieren, wurde PGSS mit der CRISPR/Cas9-Methode kombiniert. Dies führte zu einer neuen Methode, die CGSS (aus dem Englischen: CRISPR/Cas9-facilitated engineering with Growth-coupled and Sensor-guided in vivo Screening) genannt wird. Die Effizient dieser Methode wurde zuerst bei der Optimierung der 3-deoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase, einem Schlüsselenzym im Chorismatsftoffwechselweg, aufgezeigt. E. coli besitzt drei Isoenzyme der DAHP-Synthase: AroG, AroF, und AroH. Ziel war es, verschiedene AroG-Varianten mit erhöhter Resistenz gegenüber einer Feedbackinhibierung durch L-Phenylalanin (Phe) zu erhalten. Ausgehend von einem Trp-produzierenden E. coli Stamm (mit der AroG-Referenzvariante AroGS180F), wurden alle endogenen DHAP-Synthasen entfernt, was das Wachstum dieses Stamms abhängig von den eingeschleusten AroG-Varianten machte. Die unterschiedlichen katalytischen Aktivitäten der verschiedenen AroG-Varianten führen zu unterschiedlich hohen intrazellulären Trp-Konzentrationen, die über den Trp-Biosensor nachverfolgt werden können. Unter Berücksichtigung der Wachstumsrate und der Signalstärke des Biosensorsignals als Selektionskriterien, konnten erfolgreich verschiedene neue Phe-resistente AroG-Kandidaten identifizieren werden. Die Ersetzung von AroGS180F mit der besten Variante AroGD6G-D7A in einem Trp-produzierenden Stamm konnte die Trp-Produktion signifikant um 38.50% steigern. Ein hoher Glukoseumsatz und eine hohe Ausbeute sind Schlüsselparameter für eine kosteneffektive Trp-Produktion. Theoretische Überlegungen legen nahe, dass die Aktivierung der Galaktose-Permease/Glukose-Kinase (GalP/Glk) in einem PTS-negativen E. coli Stamm mit einer signifikant erhöhten Trp-Ausbeute resultieren kann. Um diese Überlegung experimentell zu überprüfen, wurde ein „Laboratory Adaptive Evolution“ (LAE) Ansatz verfolgt. Hieraus folgte ein GalP/Glk-abhängiger E. coli Stamm G028, in dem das ptsI-Gen deletiert wurde und ein Tandem-Gene-Circuit mit einer Promotermutation (ptacMT-galP-pJ23119MT-glk) integriert wurde. Die resultierenden Mutanten wurden unter satzweiser LAE einem Selektionsdruck ausgesetzt und es wurde eine verbesserte Variante (B3) erhalten. Jedoch zeigte sich in anschließenden Fedbatch-Fermentationen, dass die erreichten Produktionstiter des B3 Stamms nicht höher als die von S028 waren. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass die PTS-negative Variante durch das LAE eher dazu gezwungen wird, ihr Wachstum als die Trp-Produktion zu stärken. Deshalb wurde ein weiteres LAE-System entwickelt, das die CGSS-basierte in vivo Mutagenese mit einer Echtzeitmessung des Zellwachstums und der Fluoreszenzintensität kombiniert. Hierdurch wurde ein neuer Kandidat (D8) erhalten. Weitere Fermentationen mit D8 zeigten, dass der Stamm eine um 23.07% erhöhte Trp-Ausbeute als D3 hatte (0.16 vs. 0.13 g Trp/g Glukose). Zuletzt wurden zwei ausgewählte Genvarianten (aroGD6G-D7A and AntrpCR378F) in das Chromosom der Trp-produzierenden Stämme S028G und D8 integriert. Hieraus resultierten die Stämme S028AARF und D8AA mit deutlich verbesserter Trp-Produktion. Die Stämme wurden im Folgenden im Zulaufverfahren unter definierten Bedingungen in Bioreaktoren näher charakterisiert. Bemerkenswerterweise erreichte der Stamm S028AARF eine sehr hohe Trp-Konzentration (51.19 g/L) nach 65 h, was etwa 19.2% höher ist als beim vorherigen Stamm S028GΔfruR:aroGD6G-D7A (42.95 g/L). Die Fermentationen zeigten jedoch auch hohe Schwankungen beim Wachstum und der Trp-Produktion. Die Gründe hierfür sind unklar. Nichtsdestotrotz, eine Variante (D8AA-1) zeigte eine Trp-Ausbeute von 0.20 g/g (vs. 0.19 g/g bei S028AARF). Diese Ausbeute stellt den bisher berichteten höchsten Wert dar, was den Stamm für die Trp-Produktion im industriellen Maßstab attraktiv macht.Nowadays, microbes have been extensively optimized for production of L-tryptophan (Trp) from renewable feedstocks. Numerous strategies have been investigated, including tuning the gene expression levels and alleviation of negative regulations. However, it has become apparent that development of a more efficient Trp producer will be inconceivable without broader optimization of the corresponding enzymes. Thus, the present thesis aims to develop new in vivo evolution, screening and characterization methods for optimization of enzymes for Trp production. A reliable in vivo screening approach is desired to link the mutations to cell growth or to couple the inconspicuous intracellular molecules with a biomarker, for example, the enhanced green fluorescent protein (eGFP). In the first part of this thesis, a novel enzyme screening approach, namely plasmid-assisted growth-coupled and sensor-guided in vivo screening (PGSS), is developed. This approach combines the advantages of complementary auxotrophy-coupled screening with biosensor-driven in vivo characterization. The efficiency of PGSS was first demonstrated for improving an anthranilate (ANTH)-inhibited enzyme TrpC from E. coli (EcTrpC), which is composed of indole glycerol phosphate synthase and N-(5-phosphoribosyl) anthranilate isomerase. Based on a Trp-auxotrophic strain S028ΔEctrpC, a highly efficient ANTH-resistant candidate EcTrpCS58Q-P59V-S60F-K61Q was identified by using the PGSS approach. Afterwards, the PGSS approach was employed to identify an ANTH-activated TrpC from Aspergillus niger (AnTrpC). As a result, an enzyme variant (AnTrpCR378F) that showed increased ANTH activation was discovered. Fed-batch fermentation demonstrated that the strain S028ΔEctrpC containing AnTrpCR378F was able to produce more Trp (35.36 g/L) than the strain containing AnTrpCWT (31.15 g/L), indicating that the variant AnTrpCR378F is more efficient for the Trp pathway. To overcome limitations of screening performed under non-representative conditions, PGSS is combined with the CRISPR/Cas9 technique, resulting in a novel strategy called CRISPR/Cas9-facilitated engineering with growth-coupled and sensor-guided in vivo screening (CGSS). The efficiency of this method was demonstrated for the optimization of a key enzyme in the chorismate pathway, namely 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase. E. coli possesses three isoenzymes of DAHP synthase: AroG, AroF, and AroH. The aim was to obtain AroG variants with increased resistance against feedback inhibition by L-phenylalanine (Phe). Starting from a Trp-producing E. coli strain (harboring the reference variant AroGS180F), all the endogenous DAHP synthases were removed and the growth of the subsequent strain exhibited dependence on the activity of introduced AroG variants. The different catalytic efficiencies of AroG variants will lead to different intracellular concentrations of Trp, which can be monitored by a Trp biosensor. Taking cell growth rate and the signal strength of a Trp biosensor as selection criteria, several novel Phe-resistant AroG variants with higher activities were identified. The replacement of AroGS180F with the best variant AroGD6G-D7A in a Trp-producing strain significantly improved the Trp production by 38.50%. A high glucose conversion yield is a key parameter for cost-effective Trp production. Theoretical analysis suggests that activation of galactose permease/glucokinase (GalP/Glk) in a PTS-defective strain could result in an E. coli strain with significantly increased Trp yield. To explore this possibility, a laboratory adaptive evolution (LAE) approach was applied. To this end, a potentially GalP/Glk-dependent E. coli strain G028 was developed, in which the ptsI gene was deleted and a tandem gene circuit with promoter mutation (ptacMT-galP-pJ23119MT-glk) was integrated. Batch LAE of this strain resulted in a promising candidate B3. However, B3 exhibited similar Trp yield and production as S028. One conceivable explanation is that the PTS-defective strain is forced to strengthen their growth rather than Trp synthesis in conventional LAE. Thus, a continuous LAE system (auto-CGSS) was developed which combines CGSS-facilitated in vivo mutagenesis with real-time measurement of cell growth and online monitoring of fluorescence intensity, leading to a new promising candidate strain D8. Fed-batch fermentation with D8 showed an increase of Trp yield by 23.07% compared with that by B3 (0.16 vs. 0.13 g/g). Finally, two selected gene variants (aroGD6G-D7A and AntrpCR378F) were integrated into the chromosome of Trp-producing strains S028G and D8 to establish highly producing strains S028AARF and D8AA, respectively. These strains were evaluated in fed-batch fermentations. Remarkably, S028AARF reached a very high Trp concentration (51.19 g/L) after 65h of fermentation, which is 19.20% higher than that of the previously reported strain S028GΔfruR:aroGD6G-D7A (42.95 g/L). Fed-batch cultivations of D8AA clones showed strong variations in growth and Trp production. The reason for the variations is not clear. Nevertheless, one of the clones D8AA-1 exhibited a Trp yield as high as 0.20 g/g (vs. 0.19 g/g with S028AARF), representing the highest Trp yield reported in the literature so far and making it attractive for industrial-scale Trp bioproduction.enhttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/L-tryptophan biosynthesisProtein engineeringLaboratory adaptive evolutionLibrary screening and characterizationCRISPR/Cas9 techniqueMetabolic engineeringNaturwissenschaftenTechnikDoctoral Thesis10.15480/882.320410.15480/882.3204Liese, AndreasAndreasLieseOther