2023-06-252023-06-25https://tore.tuhh.de/handle/11420/16247Die Durchflusszytometrie (DFZ) ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung aller in einer Wasserprobe enthaltenen Bakterien (Gesamtzellzahl, GZZ). Nach Färbung mit einem an DNA bindenden, fluoreszierenden Farbstoff werden die Zellen einzeln von einem Laserstrahl angeregt und deren Lichtstreuung und Fluoreszenzintensitäten über optische Sensoren detektiert. Aus der Kombination verschiedener Signale ergibt sich ein charakteristischer Fingerabdruck einer Wasserprobe, der u.a. das Verhältnis von kleinen Zellen mit wenig DNA (low nucleic acid, LNA) und großen Zellen mit viel DNA (high nucleic acid, HNA) widerspiegelt. Eine Messung der GZZ dauert nur wenige Minuten. Demgegenüber erfassen klassische Kultivierungsmethoden nur 0,01 bis 0,1 % der GZZ und die Ergebnisse einer Koloniezahlbestimmung nach TrinkwV liegen frühestens nach 48 Stunden vor. Der Zeitvorteil und die Verfügbarkeit von mobilen sowie neuerdings auch Online-Geräten sind wesentliche Faktoren für einen erfolgversprechenden Einsatz der DFZ in der Wasseranalytik. Zusätzlich kann mit der DFZ zwischen lebenden (membranintakten) und membrangeschädigten (toten) Zellen unterschieden werden. Dies ermöglicht die genaue Untersuchung der Wirksamkeit von Desinfektionsverfahren. Der in verschiedenen Publikationen pauschal propagierte Einsatz der DFZ zur Überwachung von Desinfektionsverfahren ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Wirkungsprinzipien kritisch zu betrachten - speziell bei der UV-Desinfektion. Ziel dieses Projektes ist es, Potenzial und Grenzen dieser zukunftsweisenden Technologie herauszuarbeiten. Die Durchflusszytometrie soll für verschiedene Einsatzbereiche weiterentwickelt und validiert werden. - Schnelle Messung der Gesamtzellzahl (GZZ) in verschiedenen Matrices - Schnelle Charakterisierung von Rohwasser oder Trinkwasser - Spezifischer Nachweis von Fäkalindikatoren - Kontrolle der Wirksamkeit der Desinfektion Ein Vergleich der Ergebnisse der DFZ mit klassischen Kulturverfahren soll die Relevanz von DFZ-Daten für die hygienische Bewertung der Wasserqualität aufzeigen. Für eine weitestgehend praxisnahe und praxisorientierte Entwicklung der Durchflusszytometrie werden möglichst unterschiedliche reale Proben von Wasserversorgern untersucht. Die DVGW-Forschungsstelle TUHH beteiligt sich im Rahmen des Gesamtprojektes mit folgenden Arbeiten: - Teilnahme an Ringversuchen zur Bestimmung der GZZ, des Verhältnisses von LNA/HNA-Zellen und des Anteils der lebenden (membranintakten) Zellen an der GZZ - Untersuchung der mikrobielle Dynamik in Aufbereitungsprozessen verschiedener Rohwässer und in der Verteilung (Fernwasserleitung) - Kontrolle der Desinfektion: Untersuchung der Auswirkungen von Chlordioxid auf die lebend/tot-Differenzierung der Zellen in Laborversuchen mit unterschiedlichen realen Trinkwässern - Messung der Auswirkungen von verschiedenen Wassermatrices (z.B. Partikel, gelöste Inhaltsstoffe) auf die bakteriellen DFZ-Signale - Hygienische Relevanz der Daten: Interpretation der Durchflusszytometrie-Daten und Bewertung ihrer hygienischen Relevanz durch Vergleich mit den Ergebnissen der kulturellen Routineverfahren - Anpassung von Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für die Probenahme, Probenkonservierung, Geräteeinstellungen und QualitätskontrollenFlow cytometry (FCM) is a powerful method for the quantification of all bacteria in a water sample (total cell count, TCC). After staining with a DNA-specific fluorescent dye every single cell is excited by a laser beam and its light scattering and fluorescence intensity is detected by optical sensors. The combination of different signals gives a specific fingerprint of a water sample showing e.g. the proportion of small cells with a low DNA content (LNA) to big cells with a high DNA (HNA) content. The measurement of a TCC takes only a few minutes. In contrast culture methods detect only 0.01 to 0.1 % of the TCC and the determination of colony counts according to the german drinking water ordinance require at least 48 hours. The time saving and the availability of mobile and recently also of online-instruments are important arguments for a promising application of FCM in water analysis. Additionally, FCM can differentiate between live (membrane intact) and dead (membrane damaged) cells which allows the detailed investigation of the efficacy of disinfection methods. Several publications propose the general application of FCM for the surveillance of disinfection methods. However, this has to be regarded critically due to different mechanisms of action of disinfectants - especially with regard to UV-disinfection. The objective of the project is to determine the potential and the frontiers of this forward-looking method. The FCM should be further developed and validated for different fields of application: - Fast measurement of total cell counts (TCC) in different matrices - Fast characterization of raw water and drinking water - Specific detection of fecal indicators - Surveillance of the efficacy of disinfection The comparison of the results from FCM with classical culture methods should reveal the relevance of FCM data for the assessment of the hygienic quality of the water. For an as far as possible close-to-practice development of flow cytometry real water samples of preferably different compositions from water utilities will be analyzed. The DVGW-Forschungsstelle TUHH performs the following work program in the overall project: - Participation in interlaboratory tests for the determination of TCC, LNA/HNA-ratio and proportion of live (membrane intact) cells - Analysis of the microbial dynamics in treatment processes of different raw waters and during distribution (long-distance water main) - Surveillance of disinfection: investigation of the effect of chlorine dioxide on the live/dead differentiation of cells in laboratory experiments with different drinking water qualities - Measurement of the effect of different water matrices (e.g. particles, dissolved compounds) on bacterial FCM-signals - Hygienic relevance of the data: interpretation of FCM-data and evaluation of their hygienic relevance by comparison with the results from routine culture techniques - Adaptation of standard operation procedures (SOPs) for sampling, sample fixation, instrument settings and quality control