Zeng, An-PingAn-PingZeng11381282790000-0001-9768-7096Bahnemann, Janina StephanieJanina StephanieBahnemann2014-04-142014-04-142014782853390http://tubdok.tub.tuhh.de/handle/11420/1168Metabolomische Analysen bilden einen entscheidenden Schritt zum Verständnis zellulärer Funktionen auf genomischer Ebene. Verlässliche metabolomische Analysen unter physiologischen oder in vivo Bedingungen werden insbesondere für systembiologische Untersuchungen zur Beschreibung der Interaktionen von Stoffwechselreaktionen und ihrer Dynamik benötigt. Während genomische, proteomische und transkriptomische Daten heutzutage mit hoher Präzision generiert werden können, gestaltet sich die Bestimmung von Metabolitenprofilen nach wie vor schwierig. Dies liegt einerseits an den schnellen Umsatzraten, den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stoffwechselwegen und der chemischen Diversität von Metaboliten. Auf der anderen Seite bildet die Kompartimentierung des Stoffwechsels tierischer Zellen eine große Herausforderung, da hierdurch eine dynamische Spannbreite von Metabolitkonzentrationen innerhalb des Zytosols und der Mitochondrien vorliegt. Zur Bewältigung der Schwierigkeiten der Zellkompartimentierung wurde in der vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen, die schnelle und effiziente Separation zytosolischer und mitochondrialer Kompartimente von Säugetierzellen durch neue technologische Ansätze sowohl im Makromaßstab als auch im Mikromaßstab, auf einem „Lab-on-a-Chip“ (LoaC), zu erzielen. Wegen ihrer beachtlichen industriellen Bedeutung wurde innerhalb dieser Forschungsarbeit die Suspensionszelllinie CHO-K1 als Modell-organismus verwendet. Für die Mitochondrienisolation im Makromaßstab wurden verschiedene Zellaufschlussverfahren modifiziert und getestet. Die Effizienz und Sensitivität einer jeden Methode wurden durch die Messung der Mitochondrienausbeute und der Integrität isolierter Mitochondrien bestimmt. Hierbei konnten die höchsten Ausbeuten intakter Mitochondrien für einen Zellaufschluss mittels Ultraschall und anschließender differentieller Zentrifugation erzielt werden. Parallel zu den makroskopischen Methoden wurde als Kooperationsprojekt ein Mikrochipsystem entwickelt, das innerhalb weniger Sekunden eine vollständige Probenverarbeitung (einschließlich Zellaufschluss) für metabolische Analysen ermöglichen sollte. Der Prototyp des LoaC wurde innerhalb dieser Arbeit erfolgreich in einen Bioreaktor integriert und für eine Gesamtdauer von 18 h betrieben. Eine kontinuierliche Probenahme konnte hierbei mittels Überdruck realisiert werden. Neben dynamischen Pulsexperimenten wurde durch dieses Mikrochip-Bioreaktor-System eine effiziente Separation der Zellen vom extrazellulären Medium erzielt. Durch eine vorangestellte Zelllyse mittels Digitonin und die anschließende Abtrennung des freigesetzten Zytosols von den verbleibenden zellulären und mitochondrialen Kompartimenten, erwies das integrierte Mikrochipsystem großes Potential, um die Limitierungen zur Analyse des kompartimentierten Metabolismus zu überwinden. Im letzten Teil der Arbeit wurden die CHO-K1 Zellen für systembiologische Untersuchungen in einem geregelten Kleinmaßstab-bioreaktor kultiviert. Hierfür wurden neben Batch-Verfahren ebenfalls kontinuierliche Kultivierungen von Mischpopulationen durchgeführt und detaillierte extrazelluläre Metabolitanalysen mittels LC-MS vorgenommen. Darüber hinaus wurden durch konfokale und hochauflösende STED-Mikroskopie die Mitochondrienstrukturen und die Verteilung mitochondrialer Proteine in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen analysiert. Zudem konnte der relative Gehalt stoffwechselrelavanter Enzyme intrazellulär durch Einsatz der ELISA-Technologie bestimmt werden. Zur Untersuchung der Abhängigkeit meta-bolischer Reaktionen vom Zellzyklus wurden Kultivierungen synchronisierter Zellen erfolgreich durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen im Vorfeld aus heterogenen Populationen mittels Elutriationszentrifugation in der G1- bzw. der S-Phase angereichert. Die Synchronität über den Zeitraum einer Batch-Kultivierung konnte mittels durchflusszytometrischer Analysen zur Bestimmung des DNA-Gehalts und des Zelldurchmessers sowie durch die erfolgreiche Applikation eines at-line Mikroskops zur kontinuierlichen Bestimmung der Zellzahl verfolgt werden. Metabolische und mikroskopische Untersuchungen synchronisierten Zellen wurden parallel dazu durchgeführt und mit den Daten der Kultivierungen von Mischpopulation verglichen. Unter anderem durch deutlich erhöhte Verbrauchsraten der Hauptsubstrate Glukose und L-Glutamin in der S-Phase und eine versetzt eintretende erhöhte Bildung von Laktat während der G1-Phase, konnte eine Zellzyklusabhängigkeit des Metabolismus gezeigt werden.Metabolomic analysis constitutes a crucial step for understanding cellular functions at a genomic level. In particular for systems biology studies, e.g. to describe the interplay of metabolic reactions and their dynamics, a reliable metabolomic analysis under physiological or in vivo conditions is required. While genomic, proteomic, and transcriptomic data can be obtained with high accuracy nowadays, the determination of metabolic profiles and fluxes still proves to be complicated. On the one hand, this is due to the fast turnover rates, the interaction between various metabolic pathways, and the chemical diversity of metabolites. On the other hand, the compartmentalization of metabolism in mammalian cells poses a huge challenge because of the dynamic range of metabolite concentration within the cytosol and the mitochondria. To overcome these limitations of metabolomic analysis, attempts have been made in this work to achieve a fast and efficient separation of the cytosolic and mitochondrial compartments by using new technological approaches in both macro and microscales. Due to its significant value, the well-known industrial cell line CHO-K1 was used as a model organism within this research project. To investigate the isolation of mitochondria in macroscale, different cell disruption methods were modified and tested. The efficiency and sensitivity of each were determined by the measure of mitochondrial yield and the integrity of isolated mitochondria. Here, the highest yields of intact mitochondria were obtained using ultrasound for cell disruption and subsequent differential centrifugation. In addition to the large-scale procedures, a microfluidic device for metabolic analysis, providing a complete sample preparation (including cell disruption) within seconds, was developed in project cooperation. In this work, a prototype of the Lab-on-a-Chip (LoaC) was successfully integrated into a bioreactor and operated for a period of 18 h. Continuous sampling was carried out by applying overpressure onto the bioreactor. Besides dynamic pulse experiments, this microchip-bioreactor system implemented an efficient separation of cells and extracellular media. Moreover, a selective cell lysis using digitonin and a subsequent separation of released cytosol from the remaining cellular and mitochondrial compartments was realised on-chip. Thus, this integrated microfluidic system provides high potential to overcome the limitations of analyses concerning compartmentalized metabolism. In the last part of this work, CHO-K1 cells were cultivated in a controlled small-scale bioreactor in order to perform systems biology studies. Therefore, detailed analyses of extracellular metabolites using LC-MS were performed under batch and continuous cultivation conditions. In addition, the mitochondrial structure and distribution of mitochondrial proteins were studied using confocal and high resolution STED microscopy. Furthermore, the relative level of enzymes involved in metabolic reactions was measured intracellularly by using the in-cell ELISA technology. To investigate the dependence of metabolic reactions on different cell cycle phases, the cultivation of synchronized cells was performed. For this purpose, cells from heterogeneous populations were enriched in the G1- and S-phase, respectively, using the centrifugal elutriation method. The synchrony during batch cultivation was determined flow cytometrically by analysing the DNA content and the cell size distribution. In addition, the cell count was observed continuously due to the effective integration of an at-line microscope. Metabolomic and microscopic studies of synchronized cells were performed during cultivation and the resultant data were compared to that obtained during cultivation of heterogeneous cell populations. The cell cycle dependency of metabolism was shown by the increased consumption rates of glucose and glutamine within the S-phase and the shifted increased lactate production during G1-phase, amongst others.dehttp://doku.b.tu-harburg.de/doku/lic_mit_pod.phpZellkompartimentierungMitochondrienkompartimentierter StoffwechselCHO-K1-ZellenZellaufschlussMitochondrienisolationMikrofluidikcell compartmentalizationmitochondriacompartmentalized metabolismCHO-K1 cellscell disruptionmitochondria isolationmicrofluidicsDoctoral Thesisurn:nbn:de:gbv:830-tubdok-1266710.15480/882.1166ZellbiologieMitochondriumZellaufschlussMikrofluidikSystemintegrationStoffwechsel11420/116810.15480/882.1166930768299PhD Thesis